III. Tối ưu hoá phép phân tích sắc kí lỏng.
Tối ưu hoá một phép sắc kí là nghiên cứu các điều kiện tối ưu để phép tách sắc kí được thực hiện hoàn toàn.
1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu đưa vào cột tách của HPLC phải ở trạng thái lỏng do đó nếu mẫu là chất khí hay là chất rắn thì phải hoà tan bằng một dung môi thích hợp để chuyển chất phân tích về trạng thái lỏng (xử lí mẫu). Dung môi hoà tan chất phân tích thường là dung môi được chọn làm pha động. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích và mẫu chứa chất phân tích mà chọn phương pháp xử lí mẫu phù hợp.
Các phương pháp xử lí mẫu như: Kỹ thuật vô cơ hoá ướt, kỹ thuật vô cơ hoá khô, kỹ thuật khô ướt kết hợp, các kỹ thuật chiết (chiết thông thường, chiết pha rắn, chiết pha khí, chiết siêu âm…), các kỹ thuật sắc kí, các kỹ thuật chưng cất, kỹ thuật điện phân…
Ví dụ: Chuẩn bị mẫu để xác định hàm lượng vitamin A trong mẫu rau quả.
Lấy 10 gam mẫu đã nghiền mịn cho vào bình nón có nút nhám, thêm 20 gam Na2SO4khan, 1 gam MgCO3 khan, 40 mL dung môi n – hexan, lắc chiết 5 phút, để lắng, gạn lấy dung dịch. Thêm 40 mL dung môi n – hexan vào bã và lắc chiết tiếp. Lọc lấy dung dịch và gộp cả hai lần dung dịch n – hexan vào bình cất quay chân không. Cất quay từ từ cho dung môi n – hexan bay hơi (giữ nước làm lạnh 4) đến còn độ 2 mL, để nguội, hoà tan bã sánh còn lại trong 5 mL MeOH hay n – hexan, ly tâm lấy dung dịch mẫu để xác định các chất vitamin A bằng phương pháp HPLC.
Lượng mẫu bơm vào (bằng van bơm mẫu):
2. Chọn các điều kiện tối ưu
- Chọn cột sắc kí:
◦ Chọn pha tĩnh phù hợp với phương pháp sắc kí:
▪ Sắc kí hấp phụ pha thường
▪ Sắc kí hấp phụ pha ngược
▪ Sắc kí phân bố lỏng - lỏng
▪ Sắc kí trao đổi ion rắn - lỏng
▪ Sắc kí hấp phụ rắn - lỏng
◦ Kích thước hạt tối ưu, độ xốp.
◦ Chiều dài cột cố định.
- Chọn pha động:
◦ Pha động được chọn phụ thuộc vào pha tĩnh. Có thể là dung môi đơn hay là hỗn hợp 2,3 dung môi trộn lẫn theo tỉ lệ thể tích nhất định để cho sự tách có hiệu quả.
◦ Chọn pha động phải chú ý các điều kiện:
▪ Trơ, không tác dụng với pha tĩnh (tránh làm hỏng chất nhồi).
▪ Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc kí.
▪ Hoà tan tốt chất phân tích để mang chất phân tích ra khỏi cột.
▪ Phù hợp với loại detectơ đã lựa chọn.
◦ Tốc độ của pha động.
◦ Chất đệm pH, chất tạo phức…

- Chọn detector và các thông số của nó để phép phân tích có độ nhạy cao nhất:
Tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích để lựa chọn detector phù hợp: Chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc tạo với thuốc thử để tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang thì chọn detector huỳnh quang, những chất có hoạt tính điện hoá thì phù hợp với detector độ dẫn, nếu chất phân tích có khả năng hấp thụ trong vùng tử ngoại - khả kiến thì dùng detector hấp thụ tử ngoại - khả kiến UV – Vis. Nếu không dùng được các loại detector trên thì dùng loại detector chỉ số khúc xạ RI.
- Chọn khoãng nồng độ: Tăng liên tục nồng độ của chất biến tính trong pha động ở các hệ pha thường và pha ngược hay thay đổi pH hoặc nồng độ đối ion trong các hệ trao đổi ion: để tách các hỗn hợp phức tạp các chất tan có sự khác nhau lớn về độ phân cực trong một lần chạy sắc kí và trong một thời gian ngắn.
- Tiến hành sắc kí với nhiều cột tách: Nhằm làm giảm thời gian tách hỗn hợp chứa nhiều nhóm chất tan khác nhau rất lớn về độ phân cực và còn tối ưu độ chọn lọc bằng cách sử dụng các cột tách với các pha động khác nhau.
- Chọn nhiệt độ thích hợp.
3. Chọn phương pháp phân tích
Dựa vào đặc điểm của chất phân tích trong hỗn hợp cần tách (phân tử lượng, khả năng hoà tan trong nước, tính chất phân cực ) mà lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp.
Ví dụ:
- Nếu những chất có phân tử lượng lớn (M >2000):
▪ Có khả năng tan trong nước: sử dụng phương pháp sắc kí gel, dung môi nước
▪ Không tan trong nước: sử dụng phương pháp sắc kí gel, dung môi hữu cơ.
- Những chất có phân tử lương nhỏ (M < 2000):
◦ Không tan trong nước:
▪ Các chất thuộc đồng đẳng: Sử dụng phương pháp sắc kí phân bố.
▪ Các chất là đồng phân: Sử dụng phương pháp sắc kí hấp phụ.
▪ Các chất có kích thước khác nhau: Sử dụng phương pháp sắc kí gel.
• Tan trong nước:
▪ Không phải là hợp chất ion: Sử dụng phương pháp sắc kí phân bố pha đảo hoặc sắc kí gel, dung môi nước.
▪ Hợp chất ion: Nếu là bazơ thì sắc kí trao đổi cation, còn nếu là axit thì sắc kí trao đổi anion.
▪ Có hợp chất ion và hợp chất không ion: Sắc kí pha đảo tạo cặp ion.
IV. Phân tích định tính, định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng
1. Phân tích định tính
Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tương ứng đã được lựa chọn có một thời gian lưu xác định. Vì vậy để thời gian lưu là tiêu chuẩn để phân tích định tính chất phân tích bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp.
Nguyên tắc:
Chạy sắc kí mẫu chuẩn theo những điều kiện tối ưu đã lựa chọn để xác định thời gian lưu của từng chất trong mẫu đó. Sau đó chạy mẫu phân tích cũng trong những điều kiện như chạy mẫu chuẩn và so sánh thời gian lưu để kết luận sự có mặt của từng chất.

Hình 1: Sơ đồ phân tích định tính
Qua sơ đồ trên ta thấy mẫu phân tích có B và C.
2. Phân tích định lượng
Tín hiệu đo là diện tích của pic hay chiều cao của pic. Để tiến hành định lượng chất phân tích, người ta sử dụng các chất chuẩn là chất phân tích có độ tinh khiết cao. Tiến hành khảo sát chất chuẩn để tìm điều kiện đo của chất chuẩn, mẩu giả và cuối cùng mới đo trên mẫu thực tế.
Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã lựa chọn thì diện tích (chiều cao) của pic tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích:
S = K.C (S: diện tích của pic)
h = K.C (h: chiều cao của pic)
Các phương trình này dùng để định lượng chất phân tích bằng HPLC, thường người ta dùng diện tích của pic để độ chính xác cao hơn.
Có nhiều phương pháp để định lượng chất phân tích, cụ thể:
a) Phương pháp ngoại chuẩn
Tuỳ thuộc vào tính chất của mẫu: hàm lượng, yếu tố cản trở, tính chất phức tạp của nền cũng như độ chính xác yêu cầu mà người phân tích có thể áp dụng các cách định lượng khác nhau: Chuẩn hoá một điểm và chuẩn hoá nhiều điểm.
 Chuẩn hoá một điểm
- Nguyên tắc: Chuẩn hoá một điểm là sử dụng một phép đo của chất chuẩn đã biết trước nồng độ, đo độc lập và song song với phép đo chất cần phân tích.
- Phương pháp này thường áp dụng:
+ Đối với chất phân tích có hàm lượng lớn hoặc đã làm giàu đến mức độ cần thiết.
+ Để đánh giá khi không yêu cầu độ chính xác cao vì ở đây đã bỏ qua các yếu tố cản, các sai số ngẫu nhiên có thể làm giảm tính chính xác của phép đo.
+ Nồng độ của chất phân tích Cx phải nằm trong khoảng tuyến tính.
- Phương pháp: Sử dụng hai phép đo độc lập:
+ Phép thứ nhất: Chạy sắc kí chất chuẩn trong điều kiện tương tự chất phân tích (nền và các thông số khác giống nhau).
+ Phép thứ hai: Chạy sắc kí chất phân tích.
Kết quả tính như sau:


Hình 2: Chuẩn hoá một điểm
Ta có:
 Chuẩn hoá nhiều điểm (phương pháp đường chuẩn)
- Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau trong điều kiện tương tự mẫu phân tích. Tiến hành phép tách sắc kí và tính diện tích của pic đối với dãy chất chất chuẩn. Sau đó dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tính biễu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tích) của pic vào nồng độ chất phân tích. Để xác định nồng độ chất phân tích Cx ta cũng thực hiện phép đo đối với chất phân tích, được Sx (hx) nhất định, đối chiếu với đường chuẩn ta có nồng độ chất phân tích trong mẩu.



Hình 3: Đường chuẩn nhiều điểm xác định chất phân tích
Phương pháp này có ưu điểm là sau khi đã dụng đường chuẩn rồi thì có thể sử dụng để phân tích hàng loạt trong cùng điều kiện được khảo sát. Nếu hàm lượng chất phân tích quá bé nằm dưới giới hạn của đường chuẩn thì phải sử dụng phương pháp làm giàu để tăng nồng độ của chất phân tích để nó nằm trong vùng tuyến tính. Trong nhiều trường hợp mẫu phân tích có thành phần phức tạp, chúng ta chưa biết chính xác nên không thể chuẩn bị dãy mẫu đầu thoả mãn những quy định cho phương pháp này do đó không xác định chính xác vị trí của đường chuẩn, vì vậy kết quả phân tích mắc sai số lớn. Trường hợp này không nên sử dụng phương pháp đường chuẩn mà tốt nhất là sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định nồng độ của chất phân tích trong mẫu.
b) Phương pháp thêm chuẩn
- Nguyên tắc của phương pháp này là dùng ngay mẫu phân tích làm nền để chuẩn bị dãy mẫu đầu.
- Chuẩn bị mẫu: Lấy một lượng mẫu phân tích nhất định (C­x) rồi thêm vào đó những lượng chính xác chất cần xác định vào C1, C2, C3, C4, C5 ta được dãy mẫu đầu có hàm lượng chất xác định là:






- Tiến hành phép tách sắc kí và tính diện tích (chiều cao) của pic đối với dãy mẫu đầu. Sau đó dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tính biễu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tích) của pic vào nồng độ chất phân tích.

Hình 4: Đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn
Xác định Cx bằng phương pháp ngoại suy: Kéo dài đường chuẩn về phía trái, đường này cắt trục hoành tại điểm Cx, đoạn OCx chính bằng giá trị nồng độ Cx cần tìm. Cũng có thể xác định Cx bằng cách từ gốc toạ độ O kẻ một đường thẳng song song với đường chuẩn, từ điểm Ao kẻ một đường thẳng song song với trục hoành, hai đường này cắt nhau tại điểm M, từ M hạ đường vuông góc xuống trục hoành. Điểm cắt này là Cx. Đoạn OCx chính bằng giá trị nồng độ Cx cần tìm.
Phương pháp này có ưu điểm là quá trình chuẩn bị mẫu dễ dàng, không cần có nhiều hoá chất có độ tinh khiết cao để chuẩn bị dãy mẫu đầu. Mặt khác lại loại trừ hoàn toàn ảnh hưởng về thành phần của mẫu cũng như cấu trúc vật lí của mẫu, những sai số ngẫu nhiên do thao tác… Phương pháp này xác định được hàm lượng chất phân tích ở nồng độ bé mà phương pháp đường chuẩn không phân tích được và cho độ chính xác cao, được nhiều người sử dụng. Nhưng phải chú ý rằng, nồng độ thêm của chất chuẩn phải theo từng bậc và khoảng cách của các bậc đó phải xấp xỉ bằng Cx thì phần nội suy tuyến tính mới chính xác.
c) Phương pháp nội chuẩn
Trong mẫu, các chất phân tích có thể bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố: ảnh hưởng nên, các điều kiện khác gây sai số hệ thống. Để loại trừ ảnh hưởng này người ta thêm vào mẫu chất nội chuẩn có tính chất gần giống tính chất của chất phân tích, có nồng độ cũng gần bằng nồng độ của chất phân tích (Cx).
Tiến hành 3 phép đo sắc kí: một phép cho chất chuẩn nội, một phép cho chất chuẩn có nồng độ xác định (từ các chất chuẩn), từ đó rút ra được hệ số ảnh hưởng Fx, phép sắc kí thứ 3 cho chất phân tích chưa biết và từ đó tính ra nồng độ của nó. Hệ số Fx chính là đại lượng đưa vào để loại trừ ảnh hưởng của nền cũng như các điều kiện đo khác.

Hình 5: Phương pháp chuẩn nội xác định chất phân tích
.

d)Phương pháp vi sai
- Phương pháp vi sai nồng độ lớn:
Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch chuẩn 1: C1
Dung dịch chuẩn 2: C2 (C2 > C1­)
Dung dịch phân tích: Cx (Cx > C1)
Tiến hành phép tách sắc kí dung dịch chuẩn 2 và dung dịch phân tích trên nền dung dịch chuẩn 1 và tính diện tích (chiều cao) của pic , . Ta có:.
- Phương pháp vi sai nồng độ bé:
Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch chuẩn 1: C1
Dung dịch chuẩn 2: C2 (C2 < C1­)
Dung dịch phân tích: Cx (Cx < C1)
Tiến hành phép tách sắc kí dung dịch chuẩn 1 trên nền dung dịch chuẩn 2 và và dung dịch phân tích. Tính diện tích (chiều cao) của pic , . Ta có:.
Phương pháp này sử dụng xác định các chất có nông độ quá lớn hoặc quá bé.